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　　熒光肌動蛋白染色，特別是使用phalloidin，通過顯微鏡深入了解細胞結構和過程的一種強大方法。這種方法可以對肌動蛋白絲進行特定的可視化，使熒光肌動蛋白染色成為科學家解答許多與細胞生物學相關問題（包括細胞骨架組織和動力學）的不可或缺的工具。

　　本實驗方案中，我們提出了一種使用µ- slide VI ^0.4六通道載玻片培養和對粘附性人纖維肉瘤細胞系HT-1080肌動蛋白熒光染色的簡便方案。

　　請注意: 在開始肌動蛋白熒光染色之前必須檢查幾個重要的參數，如最佳細胞密度，理想的細胞培養器皿及底部/涂層。此外，陽性和陰性對照是驗證染色的必要條件。因此，我們強烈建議在實驗前進行充分的文獻研究。

　　1. 材料

　　1.1. 試劑和緩沖液

　　細胞培養

　　• HT-1080細胞(85111505, Sigma Aldrich)

　　• 細胞培養基: DMEM (D6546, Sigma Aldrich)，含10%胎牛血清 (F1283, Sigma Aldrich)

　　• D-PBS (14190144, Gibco)

　　• Accutase (A1110501, Gibco)

　　熒光染色與成像

　　• D-PBS (14190144, Gibco)

　　• 福爾馬林，10%，當即可用 (HT5011, Sigma Aldrich)

　　• Triton-X-100 (A16046, Thermo Fisher Scientific)

　　• 滲透性緩沖液 (0.1% Triton-X-100 in D-PBS)

　　• 牛血清白蛋白 (BSA) (A1470-10G, Sigma Aldrich)

　　• 封閉緩沖液 (1% BSA in D-PBS)

　　• Phalloidin溶液:1µl Phalloidin- ifluor 488 Reagent (ab176753, Abcam)在1 ml封閉緩沖液中

　　• ibidi封片劑，含DAPI (50011, ibidi)

　　• ibidi浸漬油 (50101, ibidi)

　　1.2. 設備

　　• µ-Slide VI^0.4 ibiTreat (80606, ibidi)

　　• µ-Slide支架 (80003, ibidi)

　　• 標準細胞培養設備(移液槍，超凈工作臺，細胞培養箱，培養瓶，細胞培養基，血細胞計等)

　　• 倒置熒光顯微鏡與適配的濾光片組

　　2. 方法

　　2.1. 細胞培養

　　在使用μ -Slide VI^0.4之前，請閱讀使用說明書。在無菌條件下進行所有步驟。建議在細胞接種前一天將

　　µ-Slide VI0.4和細胞培養基放入培養箱中，以避免處理過程中形成氣泡。在開始實驗之前，在具有粘附細胞的標準底的細胞培養瓶（例如T75）中制備HT-1080細胞。理想情況下，在實驗當天，細胞應該是低融合和健康的。

　　在整個過程中迅速工作是至關重要的，以防止細胞干涸。

　　如未另行說明，所有給定的體積都是單通道的，所有培養步驟都是在室溫下進行的。

　　• 將10ml Accutase加入T75培養瓶中進行細胞分離；在培養箱（37°C，5%CO₂）中培養5分鐘。

　　• 收集細胞懸液，離心，并將其稀釋在少量細胞培養基中進行計數。

　　• 計數細胞，并在細胞培養基中調整到最終濃度為3 × 10⁵ cells/ml。

　　• 打開ibidi µ-Slide VI^0.4，并將其放在µ-Slide支架或合適的表面上。

　　• 將30µl HT-1080細胞懸液移液填充到每個通道中。快速填充有助于避免截留氣泡。

　　• 通過傾斜µ-Slide通道載玻片并輕敲一側邊緣，清除通道中截留的氣泡。

　　• 用隨附的蓋子蓋上儲液池。

　　• 將µ-Slide通道載玻片與支架放入培養箱(37 °C, 5 % CO₂)，讓細胞附著 ( 1小時)。

　　• 在每個儲液池中加入60µl無細胞細胞培養基。避免截留氣泡。

　　• 將µ-Slide通道載玻片與支架放入培養箱(37 °C, 5 % CO₂)，并將細胞孵育過夜。

　　•  就延長細胞培養，建議每兩天連續更換一次培養基(詳見如下2.2)。

　　2.2.  連續更換培養基

　　• 小心地從儲液池中抽吸培養基。不要從通道中吸入任何液體。

　　• 輕輕地將120µl無細胞培養基導入一個儲液池中，使通道得以補充。

　　• 從對面的儲液池中抽吸舊的培養基。使用細胞培養抽吸裝置時要小心，因為這可能會吸走部分附著的細胞或細胞簇。

　　• 每個儲液池使用60µl無細胞培養基重新填充儲液池。

以最小容量為通道容量的三倍連續更換培養基

　　2.3. 固定, 透化和封閉

　　• 快速執行所有步驟，確保通道不會干涸。為實驗準備足夠的滲透緩沖液和封閉緩沖液。

　　• 通過連續的培養基交換用D-PBS代替細胞培養基進行洗滌。

　　• 抽吸大部分D-PBS。不要全部吸出。

　　• 用100µl福爾馬林（10%）固定細胞20分鐘。

　　• 連續換液，用200µl D-PBS洗滌細胞3次。

　　• 抽吸大部分D-PBS。不要全部吸出。

　　• 在100µl滲透緩沖液中孵育細胞5分鐘。

　　• 用200µl D-PBS連續換液清洗細胞。

　　• 抽吸大部分D-PBS。不要全部吸出。

　　• 用100µl封閉緩沖液封閉20分鐘。

　　• 用200µl D-PBS清洗細胞。

　　2.4.  染色

　　• 從儲液器和通道中吸出所有D-PBS。使用5毫升注射器填充空通道，以盡量減少引入氣泡的風險。

　　• 立即將30µl的phalloidin溶液加入通道中; 在暗處培養20分鐘。樣品應盡可能放在暗處保存。

　　• 連續交換培養基，用200µl D-PBS洗滌細胞2次。

　　2.5.  封片

　　•  吸取所有D-PBS，立即加入ibidi含DAPI的封片劑進行核染色，直到通道被填滿。如果使用不同的封片劑，請注意它必須是非干燥的，以避免損壞µ-Slide。

　　•  在4°C暗處儲存，直到成像。

　　•  染色后的µ-Slide可保存4周。理想情況下，應立即進行成像，因為較長的存儲時間會降低圖像質量。

　　2.6.  成像

　　•  在熒光顯微鏡下用適當的濾光片組觀察細胞，必要時用ibidi浸漬油。

　　• 可選，疊加圖像以創建合并圖像。

　　3. 結果

　　HT1080細胞在µ-Slide VI ^0.4通道載玻片中的寬場熒光顯微成像。使用phalloidin(綠色)觀察F-actin細胞骨架。細胞核用DAPI（藍色）染色。使用Plan Neofluar 40x/0.75物鏡在蔡司Axiovert 135顯微鏡上進行成像。

　　您的熒光染色結果如果沒有您預期的那樣？請參閱 immunofluorescence troubleshooting guide